藻胆色素提取实验

文章来自:浙江优纳特科学仪器有限公司

2020.07.17

实验摘要

重组藻胆色素可作为一种较安全、可替代的药品应用于器官移植、抗炎症等方面的治疗领域。目前利用基因工程技术生产重组藻胆色素制备工艺相对简单、成本相对较低,具有大规模制备的潜在价值。本研究利用多基因组合表达技术,以大肠杆菌体内血红素为底物,通过外源导入含有hox1和pcyA基因的不同表达载体,在大肠杆菌体内构建藻胆素的生物合成途径,从而用于重组藻胆色素的规模制备。

实验所需材料与方法

1.实验原理

由于光合作用,藻类进化出了具有特定结构和功能的捕光天线系统,以红蓝藻为主的藻胆蛋白体系。藻胆蛋白是由藻胆色素与相应的脱辅基蛋白共价结合形成的,主要存在于蓝藻、红藻等细胞内,在光合作用过程中起到吸收和传递能量的作用。

藻胆色素是一类线性四吡咯化合物(分子量约600Da)。藻胆体中一般含有300~800个共价偶联的藻胆色素。与蓝藻藻胆蛋白结合的色素有4种。这四种色素分别是:藻红胆素(phycoerythrobilin,简称PEB)主要存在于PE中,藻蓝胆素(phycocyanobilin,简称PCB)主要存在于PC,APC和PEC中,藻尿胆素(phycourobilin,简称PUB)主要存在于B-PE和R-PE中,藻紫胆素(phycoviolobilin,简称PVB)仅存在于PEC中。这四种色素互为同分异构体,它们的差异表现在双键的位置和数目,从而导致不同藻胆色素间吸收波长的差异。它们可以高效地吸收红光、绿光等叶绿素a(叶绿素a,Chla)吸收较差的光区,为藻类的新陈代谢活动发挥着重要作用。

 以大肠杆菌体内血红素为底物,通过外源导入含有hox1和pcyA基因的不同表达载体,从而在大肠杆菌体内构建藻胆色素的生物合成途径。

藻胆色素生物合成途径

2.藻胆色素的检测与定量方法

采用紫外分光光度计及荧光分光光度计对其进行检测和定量。藻胆色素具有共轭双键体系,极易发生 π→π*,n→π*电子跃迁,因此可以利用荧光技术手段对其中的藻蓝胆素和藻红胆素进行检测。此外,藻蓝胆素和藻红胆素在特定的溶液中具有特定的吸收峰,从而可以根据吸收峰的位置及吸光度对其定性、定量分析。

实验操作步骤如下:

(1) 藻蓝胆素的粗提:取 100 mL 的菌液,8000 g,离心 10 min 收集菌体。所得的菌体用 40 mL 甲醇在 50°C 条件下,水浴加热 1~2 h,至菌体沉淀呈白色,8000 g,离心,10 min 取上清待用;

(2) 特征吸收峰的测定:(1)中所得的藻蓝胆素的甲醇溶液加入适量的浓盐酸(VCH3OH:VHCl=95:5),测其紫外可见光吸收曲线;

(3) 样品浓度的计算:c(mM)=A680/37.9×稀释倍数;

④ ①中藻蓝胆素的甲醇溶液,测其紫外可见光吸收曲线,并根据吸收曲线测定其荧光发射光谱。

可见光波长范围:390~760纳米。

红光:波长范围:760~622纳米;

橙光:波长范围:622~597纳米;

黄光:波长范围:597~577纳米;

绿光:波长范围:577~492纳米;

青光:波长范围:492~450纳米;

蓝光:波长范围:450~435纳米;

紫光:波长范围:435~390纳米。

3.实验用品

3.1.材料:菌种(大肠杆菌,BL21)

3.2.器材和仪器:精准天平、紫外分光光度计、荧光光谱仪、pH计、紫外检测仪、高速离心机、低温恒温槽、振荡培养箱、净化工作台、高压灭菌锅

3.3.大肠杆菌培养基:

LB培养基(1L):10g NaCl,10g胰蛋白胨,5g酵母浸粉,加去离子水至1L。

TB培养基(1L):将12g胰蛋白胨,24g酵母浸粉,4mL甘油溶于900mL去离子水中,各组分溶解后高压灭菌,冷却至60°C左右,再加100mL灭菌的17mM KH2PO4和72mM K2HPO4的溶液(2.31gKH2PO4和12.54gK2HPO4)

3.4.抗生素储备液

卡纳霉素储备液:用无菌二次重蒸水配成10mg/mL卡那霉素(kanamycin,简称Kan)溶液,分装,-20°C保存备用。使用时每毫升培养基加入3~5mL,终浓度为30~50mg/mL。

4.实验流程

4.1.活化菌种:取保藏的工程菌菌种10 μl接入装有5 ml的LB液体培养基的试管(不同的藻胆蛋白生物合成需要不同的抗生素)中,于37°C摇床振荡培养8-12小时。

4.2.扩大培养:将试管中活化的1 ml菌液接种到250 ml LB培养基,同时加入对应的抗生素,培养基于37°C摇床振荡培养。

4.3.色素蛋白生物合成:工程菌培养至OD600约为0.5-0.6,10°C水浴中放置1 hr,加入IPTG至终浓度为1mmol/L,20°C低温过夜诱导后离心收集细胞,二次蒸馏水洗两次。

4.4.离心:把菌体从发酵液里离心出来。

第一次离心

(1)首先电子秤取50g菌液到离心管内

(2)将离心管放入离心机中

第二次离心

让菌泥集中到一块儿,方便取上清液

4.5.光谱分析 吸收光谱用紫外可见光谱仪,紫外可见光谱扫描范围300~800nm,扫描速度960nm/min,狭缝宽度1.0nm。荧光光谱用荧光光谱仪,荧光光谱扫描速度1200nm/min ,狭缝宽度5.0nm。

 结果分析

1. 在第一次离心后大肠杆菌菌落呈现蓝色和红色

2.第二次离心后得到更为明显的红蓝清液

3.吸收和荧光图谱

藻蓝胆素在酸性甲醇溶液中,于680 nm 处的吸收峰是藻蓝胆素的特征吸收峰,藻红胆素在酸性甲醇溶液中,于440nm处的吸收峰是藻红胆素的特征吸收峰。

实验总结

本实验主要研究的是如何从大肠杆菌中提取藻胆色素。藻胆色素既可作为抗氧化剂应用于食品、保健品领域,又可作为荧光探针应用于疾病诊断和光学治疗领域,另外藻胆素还能够有效地减少肝损伤,促进肝细胞的增殖。藻胆素在细胞或者生命体内还可以被还原为一种类似于胆红素的物质,能够有效地抑制 NADPH氧化酶的活性,进而可以减少或治疗某些NADPH酶导致的疾病,因此藻胆色素具有广阔的应用前景和巨大的商业市场价值。

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